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物种水平的基因组是动态的，基因存在于每个个体（核心）中，也存在于个体子集（可有可无）中，共同构成泛基因组。使用来自 503 个玉米 （Zea mays） 自交系的幼苗 RNA 的转录组测序来表征玉米泛基因组，我们鉴定了 8681 个代表性转录组件 （RTA），其中 16.4% 在所有品系中表达，82.7% 在品系亚群中表达。有趣的是，通过连锁不平衡定位，76.7% 的具有至少一个单核苷酸多态性 （SNP） 的 RTA 可以定位到单个遗传位置，主要分布在基因组的非着丝粒周围部分。RTA 的逐步迭代聚类表明，在本研究中使用的基因型的背景下，玉米基因组受到限制，并且在该种质基础中对幼苗 RNA 进行进一步采样将导致最小的发现。基于泛基因组中 SNP 和转录本丰度的全基因组关联研究揭示了与幼年到成人营养人和营养人到生殖发育转变的时间相关的基因座，这两个特征对适应性和适应很重要。这项研究揭示了玉米泛基因组的动态性质，并表明很大一部分变异可能位于一个物种的单个参考基因组之外。

内容来自文献

Hirsch C, Foerster J, Johnson J et al. (2014) Insights into the Maize Pan-Genome and Pan-Transcriptome. The Plant Cell 26(1):121-135. https://doi.org/10.1105/tpc.113.119982

参考文献格式化使用：https://dataholdcn.cn/ckwx/

TY  - JOUR
AU  - Hirsch, Candice N.
AU  - Foerster, Jillian M.
AU  - Johnson, James M.
AU  - Sekhon, Rajandeep S.
AU  - Muttoni, German
AU  - Vaillancourt, Brieanne
AU  - Peñagaricano, Francisco
AU  - Lindquist, Erika
AU  - Pedraza, Mary Ann
AU  - Barry, Kerrie
AU  - de Leon, Natalia
AU  - Kaeppler, Shawn M.
AU  - Buell, C. Robin
T1  - Insights into the Maize Pan-Genome and Pan-Transcriptome  
PY  - 2014
Y1  - 2014/01/01
DO  - 10.1105/tpc.113.119982
JO  - The Plant Cell
JA  - Plant Cell
VL  - 26
IS  - 1
SP  - 121
EP  - 135
SN  - 1040-4651
AB  - Genomes at the species level are dynamic, with genes present in every individual (core) and genes in a subset of individuals (dispensable) that collectively constitute the pan-genome. Using transcriptome sequencing of seedling RNA from 503 maize (Zea mays) inbred lines to characterize the maize pan-genome, we identified 8681 representative transcript assemblies (RTAs) with 16.4% expressed in all lines and 82.7% expressed in subsets of the lines. Interestingly, with linkage disequilibrium mapping, 76.7% of the RTAs with at least one single nucleotide polymorphism (SNP) could be mapped to a single genetic position, distributed primarily throughout the nonpericentromeric portion of the genome. Stepwise iterative clustering of RTAs suggests, within the context of the genotypes used in this study, that the maize genome is restricted and further sampling of seedling RNA within this germplasm base will result in minimal discovery. Genome-wide association studies based on SNPs and transcript abundance in the pan-genome revealed loci associated with the timing of the juvenile-to-adult vegetative and vegetative-to-reproductive developmental transitions, two traits important for fitness and adaptation. This study revealed the dynamic nature of the maize pan-genome and demonstrated that a substantial portion of variation may lie outside the single reference genome for a species.
Y2  - 9/6/2024
UR  - https://doi.org/10.1105/tpc.113.119982
ER  - 

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甲基化是一种重要的生物化学过程，涉及将甲基基团（-CH3）添加到分子上。这种修饰可以影响分子的功能和活性，并在许多生物过程中发挥关键作用，包括基因表达调控、DNA修复、细胞信号传导和蛋白质功能。在哺乳动物中，最常见的甲基化形式是5-甲基胞嘧啶，即甲基基团被添加到胞嘧啶的第5碳原子上。

甲基化测序一般有两种常见方法：

（1）TAPS方法；（2）重亚硫酸氢盐法。

第一种方法用TET酶，将甲基化的C碱基转换成

然后在吡啶硼烷的作用下转变成二氢尿嘧啶。

二氢尿嘧啶在PCR的过程中会被识别成T。这样，C就变成了T，通过测序，比较哪些C变成了T，则知道哪些被甲基化了。转化效率99%。

第二种方法是用亚硫酸氢盐处理，没有甲基化的的C会与亚硫酸氢根反应，并结合到6位。结合了亚硫酸氢根的非甲基化的C会脱氨基、脱亚硫酸氢根，形成U。根据测序，看C是否变成T来确定该位点是否被甲基化或羟甲基化。变化的是没有甲基化的位点，没有变化的是具有甲基化的位点。转化效率99%。

甲基化和羟甲基化的区分。使用高钌酸钾（KRuO₄）处理羟基化的C，可以生成甲酰化的C，在亚硫酸氢盐的作用下变成U。而甲基化的C不能被转化成U。转化效率94%左右。

需要注意的是，亚硫酸氢盐会引起DNA断裂，但是其使用的PCR循环数较少，不易引起PCR重复次数不同导致的文库不均一性。

当碱基非常平衡时，也就是A、T、C、G比例协调时，检测的准确性较高。然而，由于亚硫酸氢盐把C变成了T，会造成比例极不协调，测序准确性大幅降低。此时，通常在测序时加入基因组文库，以平衡碱基比例。

检测C的转化效率，用大肠杆菌生产出来的完全没有甲基化的λ噬菌体DNA做内参。也可以使用完全甲基化的CpG岛查看甲基化对亚硫酸氢盐的抵抗效应。

测得得结果需要与基因组DNA进行比对，但是，由于所有得C都变成了T，直接比对是不对不上的，需要将基因组DNA的C都变成T；同时，将反义链的G变成A，才能比对上。

短串联重复DNA（Short Tandem Repeat，STR），也叫做微卫星DNA（Microsatellite DNA），简单序列重复（Simple Sequence Repeats，SSR）。

一般，一个人的常染色体上的一个SSR位点，一个来自父亲，一个来自母亲。这样的位点多找几个，就会发现几乎是独一无二的特征。根据此特征，可以区分个体。

ABI公司GloBalFiler亲子鉴定试剂盒，共检测23个位点，理论上1.4×10²⁵个人当中，会有两个完全一样的SSR数据的人。当孩子的一半SSR位点与父亲的一半SSR位点能够对应上，则该判定为生物学父子。

如果是同卵双胞胎，SSR会完全一致，不能用该方法区分。

Nanopore测序的核心部件是纳米级的小孔，该小孔由蛋白质构成，称为”pore”。这个蛋白质插在电阻率很高的薄膜上，薄膜两侧浸入含有离子的水溶液当中。在薄膜两侧加上不同的电位，形成电位差，粒子就会穿过薄膜，向一个方向移动。蛋白上的小孔就会检测到电流。当DNA的单链通过小孔的时候，就会对离子的流动造成阻碍。不同的碱基对电流的影响不同，因此，可以根据电流的变化反推碱基是什么。

这个带有孔的蛋白，叫做”Reader”。用作Reader的蛋白，一般是天然形成穿膜孔的跨膜蛋白，再经过基因工程改造。

在测序时，需要用到DNA解旋酶解开DNA双螺旋，其中一条链通过跨膜蛋白。

该方案处理序列的速率非常快，第9代芯片，每秒可以处理250个碱基。10分钟可以测定150万碱基的整条单链。

这种测序仪的体积非常小，只有U盘大小。

存在问题：

1. 一些位置没有穿模蛋白，或蛋白不通。
2. 同一个位置有多个穿膜蛋白，互相干扰。
3. 电流过大造成膜损坏。

文库构建：

包括了1D和1D²两种文库。1D用于单链测序，1D²将两条链接上，然后依次测定。

由于膜具有一定的宽度，测定的电流变化实际上是5个碱基共同作用的结果，电流大小和变化由机器学习建模。1D有85%的准确率，1D²有90%的准确率。

生物用的芯片通常是硅做的薄片。玻璃板上会有无数的小帽子，是保护基团，用来防止DNA延长反应。这些保护基团对光敏感，当受到紫外照射时，这些保护集团从羟基上脱落，将羟基暴露出来。这个过程叫做光蚀。

用遮罩板挡在玻璃片上方，露出一部分方格。在紫外光的照射下，羟基露出，再加入A碱基，则A碱基与羟基连接，固定在玻璃片上，然后再加上保护基团。

再用另一块遮罩挡在玻璃板上方，同理可以将C固定上去。如此往复，可以把一串碱基固定在玻璃片上。最后，所有这些固定在这些玻璃片上的一串串碱基，就叫做探针。

玻璃板上可以分出许多区段，叫做Feature，每个Feature上有几百万相同探针。