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  • Ion Torrent芯片测序与油包水PCR

    Ion Torrent测序技术是一种基于半导体的下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）技术。它利用了半导体芯片上的微电极来直接检测DNA合成过程中产生的氢离子H+。

    在DNA合成过程中，每当一个新的核苷酸被DNA聚合酶加入到生长中的DNA链上时，一个氢离子会被释放出来。Ion Torrent技术的关键在于，它使用一个半导体芯片来检测这些氢离子的释放。每个微孔（well）中的DNA合成事件会导致局部的pH值变化，这种微小的pH变化可以通过半导体芯片上的微电极转化为电信号。然后，这些电信号被检测并记录下来，最终转换为DNA序列信息。

    具体步骤：

    （1）文库构建

    与大部分文库构建方式相同。

    （2）文库加接头

    正常的带有PCR引物的序列会引起测序读长缩短，针对这种情况，用PuFa试剂去除大部分引物序列（专门修饰过的引物序列）。再对这些含有少量引物的序列加接头。

    接头包括3种，P1接头，A接头和X接头。X接头是在A接头的基础上，增加了barcode，用于区分不同的样本。A接头用于测序起始。P1接头连接微珠。

    （3）油包水PCR（emulsion PCR）

    用油相把水项（小液滴）分开，水项中包含了测序所需的所有物质。微珠表面布满了与P1接头互补的序列，用于捕获目标序列。PCR之后，磁珠表面会积累很多小液滴。

    PCR引物携带生物素，会与磁珠上带有的链霉亲和素紧密结合，再被磁铁吸附，实现与其他杂质的分离。

    （4）芯片测序

    Ion Torrent芯片上有数千万个小孔，每个小孔容纳1个测序磁珠。每个小孔相当于一个PH计，可以根据酸性的变化确定是否连接上碱基。每次测试时，将特定的dNTP流过小孔，若发生连接，则会有PH变化，否则PH保持不变，PH改变后的电信号传入电脑，确定该碱基。

    需要注意的时，油包水PCR中，每个液滴如果包含了多个克隆，那么测序是不准确的。

  • NCBI查询核苷酸序列主要翻译

    https://wp.me/p80aHo-1nE

  • NCBI查询Gene的主要翻译

    HBB-hemoglobin-subunit-beta-Homo-sapiens-human-Gene-NCBI下载

  • BLAST首页的主要翻译

  • NanoString测序，双探针测序方案

    NanoString技术是一种用于检测和量化特定核酸序列的高通量分子测量方法。它采用两种探针，捕获探针（Capture Probe）和报告探针（Reporter Probe）。

    捕获探针通常由一个核酸序列构成，该序列能够特异性地与目标核酸的一部分互补配对。捕获探针的另一端附着有一个固定化分子——生物素，使得探针能够固定在芯片上。

    报告探针同样包含一个能够与目标核酸另一部分特异性结合的核酸序列。与捕获探针不同的是，报告探针的另一端附有一个独特的彩色条形码（一系列彩色珠子），这些彩色的珠子用于识别当前探针对应的是哪条序列。

    捕获探针与目标序列的5’端结合，报告探针与3’端结合，形成捕获探针-目标序列-报告探针的复合物。

    具体步骤：

    1. 把mRNA样品裂解。
    2. 裂解液与探针结合。
    3. 洗脱未成为复合物的杂质。
    4. 将捕获探针-目标序列-报告探针复合物固定在带有链霉亲和素的芯片上。
    5. 利用电场使带电的彩色珠子倒向一边，并拉直序列。
    6. 利用光学扫描仪读取数据。

    该方法不需要使用PCR扩增，能够真是的反应特征序列的数量。直接使用裂解液即可完成，不需要RNA提取和反转录。可以容忍一定成都的降解。实验重复性好。一次性可以测定数百种片段。

  • NCBI首页的关键位置翻译

    National-Center-for-Biotechnology-Information下载

  • 另一种RNA测序

    RNA测序，为了提取mRNA，可以用PloyT的探针。但是，如果想测miRNA、lncRNA、mRNA等的总RNA，又不想被rRNA干扰，那么只能针对rRNA设计探针。

    前面说过，rRNA的序列是特定的，但是分为不同的类型。以真核细胞为例，rRNA有18SrRNA、5.8SrRNA、28SrRNA和5SrRNA等4种类型。那就要针对4种类型都设计探针，以拉取这些RNA。

    需要注意的是，不同物种的rRNA类型和序列是不同的，这就需要针对不同物种设计不同的探针集合。这一点不像PloyT探针具有光适性，可以跨物种使用。

  • 转基因的由来

    在20世纪初，美国的果园和蔬菜田中频繁出现一种神秘的病害，这种病害导致植物根附近长出奇怪的肿瘤，就好像植物体内长出了一个个异形的“冠冕”，叫做冠瘿（crown gall）。

    与能够固氮的根瘤不同，这种冠瘿会单方面的吸取营养，导致植物营养不良甚至死亡。

    1907年，一位名叫Smith Erwin的植物病理学家开始了对这一现象的系统研究。

    经过无数次的实验和失败，Smith终于在植物肿瘤中发现了一种常见的土壤细菌，他将这种细菌命名为根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）。经过深入研究发现，这种细菌能够将自身的一部分DNA转移到植物细胞中，导致植物细胞不受控制地增殖，形成“肿瘤”。

    冠瘿的形成过程大致如下：

    （1）土壤中的根癌农杆菌与植物的根系接触，打通农杆菌细胞与植物根细胞的通道，植物细胞中的一些信号物质会进入到农杆菌细胞中。

    （2）农杆菌细胞发现某种根系细胞的信号物质，会将农杆菌细胞内的Ti质粒（环状DNA）上携带的T-DNA切除，再形成T-DNA单链。

    （3）单链T-DNA通过连接通道进入植物细胞，植物自身的重组机制会把该单链整合到核基因组上。

    （4）T-DNA基因表达，生成大量的生长素和细胞分裂素，从而导致植物的根、茎、叶等部位形成瘤状突起。

    植物信号的响应、T-DNA的切除、解双链、T-DNA的转运都与Ti质粒上的vir基因簇有关，vir基因簇可以看作是一个工具箱。

    科学家正是利用了根癌农杆菌能将自身DNA转移到其他物种的机制，实现了基因的跨物种转移，转基因技术应运而生。这种通过摄取外源遗传物质（DNA或RNA）而发生遗传学改变的过程叫做遗传转化。

  • 碱基的化学式

    Adenine腺嘌呤

    Guanine鸟嘌呤

    Thymine胸腺嘧啶

    Cytosine胞嘧啶

    uracil尿嘧啶

  • 非PCR方法实现扩增

    PCR不同的扩增子的效率不同，扩增子即便在前面几个循环只有很少的差异，随着循环的增多，差异会呈指数级增加。

    EpiCentre公司开发了一种叫做TargetAmp方法，该方法并不使用PCR实现序列的扩增。

    它在Ploy（T）尾巴上连上一个启动子——T7-Oligo (dT) Primer，我们简称T7。Ploy（T）与Ploy（A）结合，经过逆转录获得第一条cDNA链。

    然后将RNA链洗脱掉，只保留cDNA的单链。随后，利用聚合酶，得到双链cDNA。注意，此时的两条cDNA链都有T7。

    RNA聚合酶可以识别T7实现转录，这样就可以利用转录来实现体外的mRNA的扩增。