Ion Torrent测序技术是一种基于半导体的下一代测序(Next-Generation Sequencing, NGS)技术。它利用了半导体芯片上的微电极来直接检测DNA合成过程中产生的氢离子H+。
在DNA合成过程中,每当一个新的核苷酸被DNA聚合酶加入到生长中的DNA链上时,一个氢离子会被释放出来。Ion Torrent技术的关键在于,它使用一个半导体芯片来检测这些氢离子的释放。每个微孔(well)中的DNA合成事件会导致局部的pH值变化,这种微小的pH变化可以通过半导体芯片上的微电极转化为电信号。然后,这些电信号被检测并记录下来,最终转换为DNA序列信息。
具体步骤:
(1)文库构建
与大部分文库构建方式相同。
(2)文库加接头
正常的带有PCR引物的序列会引起测序读长缩短,针对这种情况,用PuFa试剂去除大部分引物序列(专门修饰过的引物序列)。再对这些含有少量引物的序列加接头。
接头包括3种,P1接头,A接头和X接头。X接头是在A接头的基础上,增加了barcode,用于区分不同的样本。A接头用于测序起始。P1接头连接微珠。
(3)油包水PCR(emulsion PCR)
用油相把水项(小液滴)分开,水项中包含了测序所需的所有物质。微珠表面布满了与P1接头互补的序列,用于捕获目标序列。PCR之后,磁珠表面会积累很多小液滴。
PCR引物携带生物素,会与磁珠上带有的链霉亲和素紧密结合,再被磁铁吸附,实现与其他杂质的分离。
(4)芯片测序
Ion Torrent芯片上有数千万个小孔,每个小孔容纳1个测序磁珠。每个小孔相当于一个PH计,可以根据酸性的变化确定是否连接上碱基。每次测试时,将特定的dNTP流过小孔,若发生连接,则会有PH变化,否则PH保持不变,PH改变后的电信号传入电脑,确定该碱基。
需要注意的时,油包水PCR中,每个液滴如果包含了多个克隆,那么测序是不准确的。